Наркотики

Выбор того или иного варианта дериватизации определяется задачей ГХ/МС-анализа. Так, при групповом анализе фенолалкила­минов предпочтительным оказывается третий вариант дериватиза­ции, поскольку он ведет к появлению общего, группового иона m/z:179 или 267 (табл.57).

Одна и та же функциональная полярная группа реагирует в различной степени в зависимости от ее положения в молекуле: гидроксил фенольный, алкильный и аллильный проявляют разную активность по отношению к некоторым агентам дериватизации (МБТФА). Стерические затруднения могут приводить к полной остановке дериватизации, например, в N-этил- или N-бутилзаме- щенных вторичных аминах.

Перед ГХ/МС-анализом необходимо удалить избыток фторсо- держащих ангидридов (ТФАА и др.), которые негативно влияют на хроматографическую систему. Силилирующие агенты обычно вводят в колонку в составе дериватизованной смеси, однако их избыток ухудшает рабочие характеристики МСД, загрязняя метал­лические поверхности.

От качества проведения всех операций пробоподготовки в зна­чительной мере зависят результаты ГХ/МС-анализа.

Для контроля этой стадии в состав серии анализируемых проб обязательно включают холостые образцы биожидкости, не содер­жащие лекарственного вещества, которые подвергаются всем опе­рациям аналогично исследуемой пробе. Холостая проба показывает собственный фон биожидкости и контролирует степень очистки от эндогенных компонентов, а также возможные загрязнения из рас­творителя и прочих реактивов ("реактивная ошибка"), материала пробок, прокладок, посуды и т.п. Эти эндогенные и экзогенные соединения образуют фон и в некоторых случаях дают на хрома- тограмме интенсивные пики, сравнимые с анализируемыми.

 

 Некоторые нежелательные процессы хроматографическо­го и масс-спектрального определения

В целях использования всех возможностей хромато-масс-спек- трального метода для получения стабильных и достоверных ре­зультатов высокой точности необходимо избежать нежелательных побочных процессов, которые могут идти при хроматографировании или в масс-спектрометре. Эти процессы приводят к потере вещества или его трансформации, что затрудняет или искажает как иден­тификацию, так и количественное измерение.

Для лекарственных и токсических веществ наиболее часто встре­чаются следующие:

—                 термическое разложение в инжекторе или в колонке: декар- боксилирование кислот; деацетилирование диацетилморфина (герои­на), в процессе которого катализатором являются металлы (никель); разложение 3-гидроксибензодиазепинового кольца (оксазепам, лора- зепам, темазепам); разложение хлордиазепоксида и его метаболита, причем в двух последних примерах регистрация масс-спектра ведется для воспроизводимо образующихся стабильных продуктов реакции;

—                 адсорбция полярных соединений в инжекторе и в колонке (морфина, барбитуратов и многих других);

—                 потери веществ из-за недостаточной летучести или непра­вильно подобранных условий хроматографического анализа.

Гомогенный ИФА более экспрессный, время проведения анализа занимает от 1 до 30 минут, включая обработку результатов. Предел обнаружения составляет от 10" до 10" г/мл. Гомогенный ИФА используется при скрининге большого количества образцов для предварительного установления факта употребления одурманива­ющих средств. Недостатком гомогенного анализа является доста­точно высокий фон.

Гетерогенные методы характеризуются высокой чувствительно­стью С10" — 10" г/мл), но более длительным временем проведения анализа (от 2 до 4 часов).

Наиболее чувствительным и удобным среди иммунологических методов количественного определения наркотических и других одур­манивающих средств в биожидкостях является поляризационный иммунофлюоресцентный анализ (ПФИА) (см. раздел 8.2). ПФИА— гомогенный конкурентный метод иммуноанализа. Поляризацию флюоресценции комплекса "антитело — антиген", меченного трас- сером-флюоресцеином, замеряют прямо в растворе, используя осо­бые свойства метки. Изменение степени поляризации испускаемого флюоресцентного света зависит от степени связывания трассера с антителом. Поляризацию флюоресценции измеряют с помощью специальной оптической системы детекции. ПФИА имеет ряд пре­имуществ перед ИФА: большую точность (до 200нг/мл), стабиль­ность метки, меньшую подверженность влиянию температуры и рН среды, характерному для фермент-субстратных отношений, а также быстроту и простоту проведения анализа. Фирмой "Эбботт" (США) создана автоматизированная система TDX для мониторинга и анализа лекарственных и наркотических средств.

В нашей стране ВНИИ биологического приборостроения выпу­скаются поляризационные флюоресцентные анализаторы АФП-2, позволяющие использовать данный метод для анализа средств, вызывающих одурманивание.

Совмещение высокой специфичности, точности анализа с экс- прессностью и простотой выполнения позволяет использовать метод иммуноанализа с помощью индикаторных полосок, дающий воз­можность осуществлять экспресс-диагностику не в лабораторных ("полевых") условиях. В основе метода лежит система детектиро­вания по принципу "ферментных каналов". Суть ее заключается в том, что ферменты, катализирующие последующие реакции пре­вращения хромогенного субстрата в окрашенное соединение, по­мещают в особое микроокружение с ограниченной диффузией. Например, если иммобилизовать их на твердом носителе, то ско­рость катализа сопряженных реакций будет выше при нахождении ферментов на поверхности твердой частицы, чем в случае раздель­ного действия ферментов.

Метод использует два фермента — глюкозооксидазу и перокси- дазу. Антитела и глюкозооксидазу ковалентно связывают с поверх­ностью индикаторной полоски — целлюлозой хроматографической бумаги. Второй фермент — пероксидазу — используют для получе­ния конъюгата с определяемым веществом.

Внутри СНГ отмечается распространение полинаркомании, свя­занной с употреблением "лекарственных коктейлей" для усиления наркотического действия, с синтезом новых наркотических средств, вызывающих "мгновенное" привыкание, и т. д.

Предлагаемое Руководство охватывает основные сферы анализа (выбор объекта, пробоподготовка, выбор аналитического метода) вещественных доказательств, биожидкостей, тканей и органов на содержание средств, вызывающих одурманивание.

В Руководство включены аналитические материалы по анализу не только собственно наркотиков, но и других лекарственных средств, активно используемых наркоманами.

Учитывая все сложности анализа (возможность фальсификации пробы, ее сокрытия, малый объем, отрицание факта употребления, присутствие в биопробе большого количества фоновых эндогенных и экзогенных веществ и т. д.), в Руководстве изложена схема предварительных и подтверждающих методов анализа (тонкослой­ная хроматография, иммунохимические методы, газожидкостная и высокоэффективная хроматография, хромато-масс-спектрометрия).

Каждый практический раздел, предваряется изложением теоре­тических основ каждого метода, что позволяет исследователю более осознанно его использовать.

В приложениях к Руководству собран материал, который необ­ходим исследователю для практического осуществления анализа и интерпретации результатов.

Все предлагаемые методики утверждены бывшим Министерством здравоохранения СССР.Большинство методических рекомендаций являются авторскими разработками сотрудников кафедры токсикологической химии Цен­тральной химико-токсикологической лаборатории ММ А им. И.М. Сеченова (Кислун Ю.В. "ГЖХ-скрининг наркотических и других одурманивающих средств в моче"; Ермаков А.Н., Смирнов А.В. "По­ляризационный флюороиммуноанализ мочи на вещества, вызыва­ющие одурманивание"; Еремин С.К., Бодрина Д.Э. (совместно с ВНИИ хроматографии). "ВЭЖХ-анализ опиатов, производных бар­битуровой кислоты, фенилалкиламинов, производных 1,4-бензоди- азепина").

В написании Руководства принимали участие также следующие сотрудники кафедры и ЦХТЛ:

Н.В. Веселовская, М.В. Белова, Е.В. Уфимцева ("Хромато-масс- спектральное определение наркотических и сильнодействующих ве­ществ в биожидкостях");

Е.А. Симонов ("Определение морфина и кодеина в волосах");

М.В.Белова ("Каннабиноиды").

Остальные разделы Руководства написаны С.К. Ереминым и Б.Н. Изотовым.

Естественно, в первом издании могут быть допущены просчеты, и авторы с большой благодарностью примут все критические за­мечания и пожелания к предлагаемому Руководству, в необходи­мости издания которого у них нет сомнения.

 

Современные иммунохимические методы ана­лиза наркотических и других одурманивающих средств отличаются высокой чувствительностью, специфичностью, простотой исполне­ния, позволяют одновременно анализировать большое число проб, не требуют дополнительной или специальной очистки пробы или концентрирования и поэтому очень удобны для скрининг-диагно­стики.

В основе этих методов лежит специфическая реакция антител с молекулами определяемого вещества (антигеном, гаптеном). Для визуализации (детектирования) результатов реакции один из ком­понентов реакции (гаптен или антитело) метят специальной меткой. В зависимости от природы применяемой метки и способа ее де­тектирования существует несколько видов иммунохимического ана­лиза (табл. 24).

Из перечисленных в таблице методов наибольшее распростра­нение в химико-токсикологическом анализе наркотических средств получили ИФА, РИА, ПФИА и иммуноанализ на основе латексной агглютинации.

В настоящее время выпускаются готовые коммерческие наборы реагентов, позволяющих выявлять основные классы одурманиваю­щих средств (опиаты, каннабиноиды, барбитураты, кокаин и др.), с гарантированным пределом обнаружения 300 — 500 нг/мл — ди- агностикумы фирм "Сива" (США), "Хоффман-ла Рош" (Швейца­рия), ИФАВ РАН (СНГ), "Эбботт" (США).

Градуировка хроматографа проводится по фе­нобарбиталу, барбамилу и этаминалу натрия. Серии контрольных растворов этих веществ готовятся в подвижной фазе в диапазоне концентраций 0,03 — 1,0 мг/мл. По результатам анализа для каж­дого вещества строятся градуировочные графики зависимости вы­соты хроматографического пика (h, мм) от содержания веществ в пробе (G, мг), где G = С • Vg; С — концентрация анализируемого вещества, мг/мл; Vg — объем вводимой дозы, мкл.

Значения градуировочных коэффициентов (К, мм/мг) для фе­нобарбитала, барбамила, этаминала натрия в соответствии с гра- дуировочной характеристикой h = К • G были рассчитаны методом наименьших квадратов.

Предел обнаружения (Gmin, мг) рассчитывается по величине такого количества вещества, которое вызывает сигнал, превышающий в 5 раз уровень флюктуационных шумов, который на шкале чувст­вительности, равной 0,1 е.о.п. (единиц оптической плотности), состав­ляет 2 мм. Отсюда минимальное значение сигнала hmin = 2 мм х 5. Значения пределов обнаружения фенобарбитала, барбамила и эта- минала натрия, рассчитанные по формуле, приведены в табл. 44.

Слюна является продуктом секреции желез ротовой поло­сти. Отобранную пробу слюны центрифугируют и для хранения замораживают, чтобы замедлить активность ферментов. Хранить лучше всего в склянках из тефлона или полипропилена, чтобы избежать поглощения следовых количеств анализируемого вещества стенками стеклянной посуды. Установлено, что неионизированные формы токсического вещества, находящиеся в водном растворе плазмы, пассивно диффундируют в слюну, так что существует прямая зависимость между концентрацией анализируемого веще­ства в слюне и его концентрацией в крови.

Волосы представляют собой относительно гомогенный (с точки зрения агрегатного состояния) биологический субстрат. Яв­ляясь легкодоступными для отбора, они представляют значительный интерес в качестве объекта при проведении химико-токсикологи­ческого анализа как на неорганические, так и на органические яды.

В последние годы установлено, что в волосах наркоманов об­наруживаются опиаты, амфетамины, фенциклидин, метаквалон, кокаин, каннабиноиды. Таким образом, возникает возможность обнаружения наркотиков в отдаленные сроки после окончания их приема и в тех случаях, когда анализ биожидкостей дает отрица­тельный результат. Важно, что наркотические вещества не мета- болизируют в волосах.

Для отбора пробы на площади около 1 см срезается прядка волос как можно ближе к основанию. При этом очень важно, чтобы волосы не изменяли своего относительного положения. Пряд­ка фиксируется липкой лентой на бумаге, помечается верх и низ прядки. Принимая во внимание скорость роста волос (примерно 1 см в месяц), образец делится на кусочки различной длины и исследуется. При этом появляется возможность проследить дина­мику поступления наркотического вещества в организм пациента. Анализ волос длиной 6 — 8 см (6 — 8 месяцев) позволяет судить о степени тяжести наркотической зависимости.

Большинство анализируемых биообъектов, со­держащих токсические вещества, делятся на следующие категории в зависимости от их морфологических особенностей, определяющих соответствующие схемы пробоподготовки.

Каждая из этих групп требует своей аналитической схемы, так как методы изолирования, описанные для мочи (тип 1), не всегда пригодны для крови (тип 2) и тканей (тип 4), и наоборот (схемы 17 — 20). Методы изолирования, которые включают этап удаления белков, обычно необходимый для типа 4, совсем не обязательны для такого биоматериала с небольшим содержанием белка, как моча.

Правильные результаты анализа в целом и экстракции в част­ности во многом зависят от доинструментального этапа, т.е. пред- аналитической техники обработки образца. Для каждого биообъекта необходимо предусмотреть в связи с его спецификой следующее: 1) корректный отбор пробы; 2) хранение пробы; 3) подготовку пробы к экстракции; 4) схему и метод экстракции; 5) наличие эндогенных и экзогенных веществ, влияющих на чистоту экстракта и конечный анализ яда и его метаболитов.

Если первые четыре фактора связаны с техникой экстракционной обработки, учет последнего фактора требует от исследователя зна­ния токсико- и фармакокинетических параметров биологической матрицы и анализируемого образца. На содержание эндогенных и экзогенных компонентов в экстракте влияют: 1) возраст, пол и вес пациента, определяющие во многом распределение яда и его ме­таболизм; 2) параллельное присутствие других экзогенных хими­ческих веществ (лекарственные средства, кофеин, табак, алкоголь и др.), изменяющих фармакокинетические и фармакодинамические параметры яда; 3) диета — свободные жирные кислоты связываются с альбуминами и конкурируют на этапе связывания яда с белком: так, если токсическое вещество введено до приема пищи, то вслед­ствие особенностей всасывания усиливается реабсорбция яда в тон­кой кишке и соответственно повышается его концентрация в крови; 4) генетический эффект — относительно человека подобная инфор­мация очень разноречива, однако необходимо отметить, что от­дельные индивидуумы обладают повышенной толерантностью к действию некоторых химических агентов; если для одних доза введенного яда является смертельной, то для других эта же доза относительно безвредна (по крайней мере не вызывает летального исхода); 5) другие факторы, действие которых необходимо предус­матривать,— болезнь (может дать повышенный фон некоторых эн­догенных соединений), работа с соединениями бытовой или инду­стриальной химии (повышенный фон эндо- и экзогенных веществ). Ниже приводятся некоторые особенности различных биообъектов.

Аналитическая служба, осуществляющая химико-токсикологи­ческий анализ средств, вызывающих одурманивание, является од­ним из инструментов государства в борьбе с наркоманией, поскольку хорошо налаженная и оснащенная аналитическая служба позволяет контролировать все вышеперечисленные уголовно наказуемые де­яния и способствует эффективной диагностике и лечению больных наркоманией.

В 1991 г. Верховным Советом РФ был принят законодательный акт, отменяющий уголовную ответственность за употребление нар­котиков и как следствие запрещающий в общем случае принуди­тельное обследование подозреваемых лиц с целью установления факта употребления наркотических и психотропных средств. Однако это не исключает возможности принудительного изъятия образцов крови, мочи и других биообъектов при необходимости проведения судебно-медицинской экспертизы в случаях, предусмотренных внут­ренним и международным законодательством.

Сложная финансово-экономическая и политическая обстановка в странах бывшего СССР и связанное с этим снижение авторитета и активности правоохранительных органов внушают большие опа­сения, что СНГ в самое ближайшее время может стать сферой активного внимания со стороны международного и отечественного наркобизнеса.

Газовый хроматограф Хром-5, колонка стеклянная, насадочная, силанизированная, длиной I метр, внутренний диаметр — 3 мм. Сорбент — 10%-ный, Карбовакс-1500 на инертоне AW-HMflS, фракция 0,16 — 0,20 мм. Газ-носитель — гелий, скорость — 75 мл/мин. Расход водорода — 30 мл/мин, расход воздуха — 400 мл/мин. Температура испарителя и детектора — 200°С. Тем­пературный режим колонки: анализ можно проводить как при программировании температуры от 130°С со скоростью 15° в минуту

Вещества данной группы в виде оснований являются летучими. Некоторые окисляются под действием кислорода воздуха. Поэтому для снижения неконтролируемых потерь на стадии выпаривания экстракта необходимо перевести анализируемое вещество в устойчивую солевую форму. Для этого используется 5%-ный раствор НС1 в метаноле, который добавляется к бензольному экстракту.

до 200°С и выдерживать конечную температуру до 12 минут общего времени анализа, так и в изотермическом режиме при 170°С для анализа эфедрона, эфедрина и норэфедрина и при 130°С для анализа метамфетамина и амфетамина. Объем вводимой пробы — 2 мкл.

Время удерживания анализируемых веществ и данные, харак­теризующие эффективность и селективность хроматографического разделения, представлены в табл. 37, 38.

Подготовка стеклянных насадочных колонок к анализу. Для удаления возможных загрязнений с внутренней поверхности колонок необходимо промыть их дистиллированной водой и органическими растворителями различной полярности в последовательности: этанол, хлороформ, ацетон, эфир (по 100 мл каждого на одну колонку). Колонки, которые ранее использовались в анализе биообразцов, перед промывкой заполнить хромовой смесью и выдержать 24 часа.

После промывки растворителями колонки промываются концен­трированной НС1 (100 мл) и дистиллированной водой до нейтраль­ной реакции среды, затем метанолом. Сушат в сушильном шкафу около 2 часов при температуре 250 — 300°С и теплыми продувают инертным газом. Заполняют 10%-ным раствором диметилдихлор- силана в безводном толуоле и оставляют заполненными на сутки. Далее сливают раствор и сушат при 150°С в течение часа. Несколько раз промывают метанолом и вновь сушат при 250° С один час.

Заполнение колонки насадкой. Концы колонки ос­тавляют незаполненными: на 2 мм конец, подсоединяемый к де­тектору; на 50 — 70 мм — конец, входящий в испаритель. Сорбент закрывают стекловатой слоем 2 — 3 мм.

Так как предполагается проводить анализ экстрактов из био­образцов, эндогенные вещества которых загрязняют испаритель и колонку, то следует использовать стеклянную вставку в колонку длиной 50 — 70 мм с воронкообразным расширением на одном конце для удобного ввода иглы микрошприца. По мере загрязнения вставка меняется на новую.

Стекловата и вставка должны обрабатываться диметилдихлор- силаном.

Кондиционирование насадки следует проводить без подсоедине­ния колонки к детектору с пропусканием газа-носителя со скоростью 20 — 30 мл в минуту. В течение первого часа колонка выдержи­вается при 100°С. Далее температура колонки изменяется со ско­ростью 3 — 5 об/мин до 290°С (колонка SE-30) и до 200°С (колонка Карбовакс-1500) и выдерживается в течение 8 — 12 часов.

 

В иммуноферментных методах для детектиро­вания реакции "антиген — антитело" в качестве метки (маркера) используются ферменты. Как правило, они представляют собой различные оксидазы, способные окислять (специальное химическое вещество — хромогенный субстрат) с образованием окрашенных продуктов. По интенсивности окраски и судят о присутствии или отсутствии наркотического средства в анализируемой пробе.

По технике выполнения различают два типа иммуноферментного анализа (ИФА): гомогенный ("Сива", ЭМИТ) и гетерогенный (ИФАВ РАН, "Хоффман-ла Рош").

В гомогенном ИФА все компоненты реакции — антитела (ан­тисыворотки), определяемое вещество, меченое определяемое ве­щество (конъюгат), хромогенный субстрат — находятся в одном агрегатном состоянии — растворе. На первой стадии анализа в реакционной среде присутствуют одновременно три компонента: аликвота анализируемой биопробы, конъюгат (определяемое веще­ство с ферментной меткой) и антитело (антисыворотка). Вследствие обратимости реакции связывания "антитело — антиген" определя­емое вещество биопробы (гаптен) и конъюгат (меченый гаптен) конкурируют между собой за ограниченное число мест связывания антитела.

Меченый антиген, связанный с антителом, не дает окраски вследствие потери активности фермента за счет пространственных затруднений. Меченый антиген получают с помощью специфиче­ских химических приемов, в результате чего определяемое вещество ковалентно связывается с ферментом.

На второй стадии анализа к реакционной смеси добавляется хромогенный субстрат, который под Действием фермента-метки претерпевает химическое изменение, превращаясь в окрашенное соединение. Полученная окраска регистрируется визуально или с помощью спектральных методов.

В гомогенном ИФА в качестве метки используются следующие ферменты: лизоцим, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа. При связывании меченого гаптена с антителом активность фер­мента-метки в реакции с хромогенным субстратом снижается за счет пространственных изменений белка фермента (блокируется доступ субстрата к ферментативным центрам). Это явление назы­вается торможением. В этом случае окраска анализируемого рас­твора после добавления субстрата будет прямо пропорциональна концентрации не вступившего в связь с антителом меченого гаптена, т.е. прямо пропорциональна концентрации конкурента — наркоти­ка, находящегося в биопробе.

В наиболее распространенных случаях гетерогенного ИФЛ ан­титело иммобилизуется на каком-либо твердом носителе, например полистирольных планшетах, пробирках, бусах.