Наркотики

Современные иммунохимические методы ана­лиза наркотических и других одурманивающих средств отличаются высокой чувствительностью, специфичностью, простотой исполне­ния, позволяют одновременно анализировать большое число проб, не требуют дополнительной или специальной очистки пробы или концентрирования и поэтому очень удобны для скрининг-диагно­стики.

В основе этих методов лежит специфическая реакция антител с молекулами определяемого вещества (антигеном, гаптеном). Для визуализации (детектирования) результатов реакции один из ком­понентов реакции (гаптен или антитело) метят специальной меткой. В зависимости от природы применяемой метки и способа ее де­тектирования существует несколько видов иммунохимического ана­лиза (табл. 24).

Из перечисленных в таблице методов наибольшее распростра­нение в химико-токсикологическом анализе наркотических средств получили ИФА, РИА, ПФИА и иммуноанализ на основе латексной агглютинации.

В настоящее время выпускаются готовые коммерческие наборы реагентов, позволяющих выявлять основные классы одурманиваю­щих средств (опиаты, каннабиноиды, барбитураты, кокаин и др.), с гарантированным пределом обнаружения 300 — 500 нг/мл — ди- агностикумы фирм "Сива" (США), "Хоффман-ла Рош" (Швейца­рия), ИФАВ РАН (СНГ), "Эбботт" (США).

В данную группу наркотических веществ вхо­дят препараты, приготовленные из различных частей конопли, наиболее распространенные: марихуана (смесь листьев, соцветия), гашиш (смолка, гашишное масло). Однако наркоманами исполь­зуются практически все части растения.

В смолке содержится около 30 различных каннабиноидов. Наиболее важные из них — это каннабидиол (КБД), каннабинол (КБ), (-)-транс-л9-тетрагидроканнабинол (д9-ТГК), (—)-транс- д8 -тетрагидроканнабинол (д8 -ТГК) и д9 -тетрагидроканнабиноло­вая кислота (Д9 -ТГК-кислота).

При курении каннабиноиды быстро (за не­сколько минут) всасываются. При этом возрастает содержание фи­зиологически активных компонентов — КБ и а9 -ТГК — вследствие разложения КБД. Уровень а9-ТГК в крови быстро нарастает, достигая максимальных концентраций через 5 — 30 минут, и быстро снижается из-за активных метаболитических процессов и распре­деления веществ в тканях.

При пероральном введении из-за плохой всасываемости в же­лудочно-кишечном тракте концентрация а9 -ТГК в крови нарастает медленно, достигая максимальных значений через 1,5 — 3 часа. Часть вещества, минуя большой круг кровообращения, депонируется и метаболизируется в печени.

Степень абсорбции а9 -ТГК при ку.рении и пероральном введе­нии индивидуальна и составляет соответственно 2 — 56 и 6 — 20%.

А9-ТГК распределяется в большей степени в тканях, богатых липидами (в печени, почках, легких, мозге; долгое время задер­живается печенью, селезенкой и костным мозгом).

При хроническом приеме а9 -ТГК депонируется в жировой тка­ни. Более полярный активный метаболит 11-гидрокси- а9-ТГК показывает меньшую тенденцию к накоплению, а 8, 11-дигидрок- си-а9-ТГК сохраняется долгое время в липидах и в печени.

Метаболизм каннабиноидов осуществляется преимущественно в печени и достаточно интенсивно. Обнаружено около 50 метаболитов веществ — компонентов конопли. Пути метаболизма, подчиняясь общим закономерностям, однако, имеют видовые и индивидуальные особенности и различны в разных тканях.

Основным неактивным метаболитом А9 -ТГК является 11 -нор- карбокси-А9-ТГК и ее конъюгат с глюкуроновой кислотой. Пер­вичный метаболит — продукт окисления по С-11 — 11-гидрокси- Д9 -ТГК — является более активным, чем исходное вещество-. Также активен 8 /3 -гидрокси- А9 ТГК.

Выведение метаболитов происходит с мочой, калом, секретом слюнных и молочных желез.

Для А9-ТГК примерно 80 — 90% дозы выводится за пять дней после приема, причем около 20% экскретирует с мочой и 65% — с калом. Количество выводимого вещества зависит от дозы и путей выведения.

Степень выведения А9 -ТГК зависит от путей введения (табл. 13, измерение) в первые сутки после приема разовой дозы.

 

С мочой каннабиноиды выводятся в виде метаболитов, основным из которых является ТГК-кислота, на 80% связанная с глюкуро- новой и серной кислотами. С фекалиями в большей степени вы­водится а9-ТГК и ТГК-кислота, конъюгированная с желчными и жирными кислотами.

Экспресс-тест образцов, подвергаемых контро­лю, может быть проведен различными способами. Наиболее рас­пространенный — это использование стеклянных или фарфоровых пластинок с углублением, куда помещается образец, который затем обрабатывается реагентом (рис. 3).

Эта пластинка должна быть промыта водой и органическим растворителем (ацетоном или метанолом) после каждого анализа.

Другая техника экспресс-теста предусматривает использование открытых тест-пробирок, куда помещается образец и обрабатыва­ется согласно методике.

Кроме того, экспресс-тесты можно проводить на фильтровальной бумаге, на специальных пластинках (стрипах) или в заранее из­меренных и упакованных теСт-ампулах.

Растение мак и опи й-с ы р е ц. Для исследований могут быть представлены куски растения и солома мака, измельченные головки мака и отвары (настои), полученные из них, опий, полученный из растения экстракционным путем. Основная цель исследования — установление наличия в представ­ленных образцах наркотических алкалоидов — морфина, кодеина, тебаина.

Если объектом исследования служат коробочки мака, их из­мельчают, удаляя предварительно семена. Далее их сушат при 60— 70°С в течение 5 часов и измельчают. Аналогичную подготовку (сушка и измельчение) осуществляют и с маковой соломой.

В случае опия-сырца и экстракционного опия образцы вначале замораживают, а затем быстро измельчают в фарфоровой ступке. Если образцы влажные, их предварительно высушивают при 60 — 70°С в течение 24 часов. Отвары (настои) можно непосредственно наносить на пластинку, предварительно профильтровав их. Для анализа растительного сырья образцы (100 мг) заливают 1 мл смеси этанола — хлороформа (1:2) или метанолом, содержащим 0,1% триэтиламина или 25% водного аммиака, и нагревают до начала кипения на кипящей водяной бане. Полученный экстракт фильт­руют и наносят на хроматографическую пластинку. Хроматогра­фирование — в системе этилацетат — этанол — 25%-ный аммиак (9:1:0,5), обнаружение— с помощью реактива Марки.

Конопля и гашиш. В качестве вещественных доказа­тельств могут фигурировать различные части растения конопли, ее метелки, мякина, гашиш и гашишное масло. Кроме того, при установлении факта употребления на исследование могут быть доставлены слюна, смывы с полости рта и с поверхности пальцев обследуемого.

При исследовании растительного сырья поступают следующим образом: от верхушечных частей конопли отделяют листья и со­цветия и перетирают их в фарфоровой чашке или через сито (диаметр ячейки не более 0,25 мм). 100 мг полученной массы за­ливают одним миллилитром этанола и осторожно нагревают на кипящей водяной бане (до начала кипения спирта). Полученный экстракт отделяют от осадка и наносят на ТСХ-пластинку для исследования.

После двукратного разделения в системе петролейный эфир — диэтиловый эфир (9:1) пластин          -20 минут при ком-

 

затем опрыскивают

 

натной температуре, изучают

раствором Прочного Синего Б (или ББ). Объект относится к гашишу либо сырью для его получения, если в нем выявлены А9-тетра­гидроканнабинол и (или) А8-тетрагидроканнабинол.

Образцы мочи (не менее 50 мкл) отбирают в пластиковые или стеклянные контейнеры. Избегать резиновых пробок. Если ото­бранная проба не анализируется в течение одного дня, ее хранят в холодильнике не более трех дней (для каннабиноидов — 24 часа). Для более длительного хранения мочу необходимо заморозить. Перед анализом пробу оттаивают и доводят до комнатной темпе­ратуры. Использование консервантов для хранения мочи не реко­мендуется.

Протереть наконечник трубки дозатора обезжиренной тканью и опустить его во флакончик с калибратором так, чтобы он не касался стенок и дна флакона. Поднять плунжер дозатора полностью (до верха красной стрелки). Вынуть наконечник трубки из флакона с калибратором, снова его протереть и поместить его над калиб­ровочной виалой. Опустить плунжер, чтобы ввести калибратор и разбавитель в виалу. Немедленно приступить к следующей стадии.

Протереть наконечник трубки дозатора и опустить его в пробу мочи. Поднять плунжер дозатора полностью. Вынуть наконечник трубки дозатора из пробы, снова ее протереть и поместить над виалой для образца. Опустить плунжер, чтобы ввести образец мочи и разбавитель в виалу.

Закрыть виалы резиновыми пробками.

Вращать держатель виал круговыми движениями до растворения порошка (10— 15 с). Это время должно быть постоянным от об­разца к образцу

Поместить держатель виал в фотометр . Убедиться, что виала с калибратором находятся слева, а виала с образцом — справа. Нажмите обе виалы вниз, чтобы световая надпись "Insert Vials" погасла.

Поместить карту результатов с цветным блоком в верхнем правом углу в щель фотометра так, чтобы погасла световая надпись "Insert Card". Оставьте карту в этом положении до напечатания результатов (« 90 с).

Удалить карту результатов и виалы из фотометра после того, как надпись "Test in progress" погаснет.

Не оставляйте виалы в фотометре — это предохранит прибор от самокалибровки.

Подождите 15 секунд, прежде чем начинать следующее изме­рение.

2.3. Контроль качества работы прибора и диагностикума

Контроль качества работы прибора проводится ежедневно, со­гласно описанной выше процедуре, используя вместо образца мочи негативный и позитивный контроли, т.е. помещая флаконы с кон- тролями в фотометр вместо образца мочи. Если система функци­онирует нормально, то позитивный контроль будет давать поло­жительный результат, а негативный — отрицательный результат, причем полученные величины абсорбции должны укладываться в интервал, указанный на этикетке коробки с реакционными виалами.

 

3.1.                        Калибровка. В карусель для калибровки поместить 12 из­мерительных кювет и 12 катриджей. В катриджи внести не менее 60 мкл каждого из 6 стандартов (делается в дубле) с помощью автоматической пипетки. Поместить карусель и набор реагентов для анализа конкретного соединения или группы веществ в прибор ТДх-анализатор. Нажать клавишу "RUN". После выполнения ка­либровки прибор готов к анализу образцов мочи. Калибровка про­водится для каждого нового набора реагентов, но не реже одного раза в месяц.

В настоящее время можно выделить два основ­ных направления в анализе объектов на 1,4-бензодиазепины: а) по продуктам гидролиза — аминобензофенонам; б) по нативным сое­динениям и метаболитам.

Первое направление предусматривает в основном кислотный гидролиз 1,4-бензодиазепинов и их метаболитов после предвари­тельной экстракции, сорбции или в процессе деструкции ткани до соответствующих аминобензофенонов с последующим использова­нием для их идентификации сочетания хроматографических (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ) и спектральных методов. Второе, более сложное, включает изолирование нативных со­единений и рада гидрофобных метаболитов экстракцией подкис­ленной водой (органы и ткани) с последующим концентрированием экстракцией органическими растворителями или сорбцией. Для биологических жидкостей используется прямая экстракция органи­ческими растворителями при рН«6 — 8 или сорбция на полисорбе-1.

Далее для обнаружения и определения оензодиазепинов и их метаболитов используется комплекс аналитических методов.

Первое направление применимо при определении хлозепида, нозепама, сибазона, феназепама, лоразепама, в меньшей степени нитразепама (при анализе лекарственных форм и на отдельных этапах исследования биологических объектов). Малоизученным ос­тается данное направление по отношению к медазепаму.

Основное преимущество исследования 1,4-бензодиазепинов по производным аминобензофенона состоит в том, что данный способ позволяет суммарно определять нативное соединение и ряд его метаболитов. Отрицательному результату анализа гидролизованных бензодиазепинов придается "отрицательное судебно-химическое значение". При положительном результате необходимо продолжать исследование по нативным соединениям, что позволит более точно установить природу яда (особенно в случае хлозепида, нозепама и сибазона).

Чувствительность аналитического метода определяется как от­ношение сигнала анализируемого вещества к сигналу базовой линии и выражается в нанограммах на миллилитр (нг/мл) или в граммах на килограмм (г/кг) биообъекта. Выбор метода с плохой чувстви­тельностью грозит необнаружением искомого вещества (ложноот- рицательный результат), и с этих позиций чувствительность пред­варительных методов очень важна, так как при отрицательном результате дальнейшего обнаружения не проводится (результат имеет отрицательное судебно-хийическое значение). Если метод обладает очень высокой чувствительностью, то наркотическое ве­щество может быть детектировано даже спустя несколько дней или недель после употребления.Под специфичностью
понимают способность метода отличать химическую структуру данного соединения от ему подобных (ана­логов).

В настоящее время при анализе на содержание наркотических и других одурманивающих средств используются аналитические методы, выбор которых определяется, с одной стороны, видом анализируемого образцу а с другой — обстоятельствами дела.

В качестве подтверждающих методов исследования используются ГЖХ, ВЭЖХ, ГХ/мС. Подтверждающие методы должны быть выше или равными по чувствительности, чтобы уменьшить коли­чество ложноотрицательных результатов, но обязательно должны быть выше по специфичности, для того чтобы снизить количество ложноположительных результатов.

Таким образом, при выборе аналитического метода необходимо учитывать его преимущества и недостатки (табл. 4). В любом случае, даже при использовании самого чувствительного метода, результаты скрининга должны быть подтверждены аналитиче­скими методами, основанными на других физико-химических принципах.

Индексы удерживания могут быть использованы для характери­стики веществ и стационарных фаз, для предсказания хроматогра- фической динамики функциональных групп или для получения ин- 4юрмации о химической структуре неизвестного соединения. Однако наибольшая ценность состоит в их применении для идентификации неизвестных веществ путем сравнения с коллекцией банка данных RI известных веществ. Применительно к ХТА такой банк данных должен содержать как можно больше веществ, имеющих токсиколо­гическое значение, их метаболиты, а также соединения, встречаю­щиеся в биологических матрицах и часто интерферирующие с ана­лизируемым соединением (пластификаторы, стабилизаторы, хлорор- ганические пестициды, полихлорированные бифенилы и т.д.).

Надежное определение значений RI в токсикологическом ана­лизе требует соблюдения следующих правил:

—                 все этапы анализа выполняются аккуратно, в постоянных условиях. Измерение времени должно быть сделано с ошибкой менее чем ± 0,5 секунды. Электронные измерения предпочтитель­ны. Если хроматограммы исследуются ручным способом, скорость бумаги должна быть по возможности наименьшей. Объем образца и его концентрация должны быть подобраны таким образом, чтобы колонка не перегружалась;

—                 неизвестное вещество или образец сначала анализируются при программируемой температуре в тех же самых условиях, в которых определены индексы удерживания н-алканов. Начальная температура должна быть около 100°С для того, чтобы детектиро­вать соединения высокой летучести, а конечная температура должна быть 280 — 300°С для детектирования соединений низкой летуче­сти. Это позволит, во-первых, найти алканы сравнения, которые необходимы, а во-вторых, выбрать температуру для частного изо­термического анализа и, в конце концов, точно определить RI неизвестного вещества. Как правило, выбранная температура дол­жна составлять Vio от значения RI неизвестного вещества. На­дежное определение RI может быть сделано в этом случае, только если температура достаточно воспроизводима. Наилучший способ определения точного RI — совместное инжектирование образца и веществ сравнения, однако это невозможно, когда хроматог- рамма содержит много пиков. В таком случае образец и вещества сравнения хроматографируются в двух последовательных опре­делениях.

Так как индексы удерживания зависят от температуры, их документирование требует информации о температуре, при которой они были определены. Однако температурную зависимость можно игнорировать при использовании достаточно большого "поискового окна". Это также применимо к значениям RI, полученным в ус­ловиях программируемой температуры. В частности, в предлагаемой табл. 34 температурная индикация может быть опущена при усло­вии, что исследователь выберет подходящую температуру и "по­исковое окно" в ±50 — 60 единиц для идентификации неизвестных веществ. Некоторые лекарственные вещества разлагаются или вы­ходят длинным хвостом на диметилсиликоновой фазе. В этом случае может быть необходимым инжектирование большого количества вещества, чтобы пик был заметен. Например, аметазол, морфин и другие фенолы, флюореназин. Из-за разложения можно получить пики, которые не являются пиками вещества, которое инжектиро­вано. Например, соединения четвертичных аммонийных оснований могут диметилироваться в инжекционном узле (на входе колонки), давая третичные амины.

В химико-токсикологическом анализе для получения идентич­ных аналитических данных исследователю необходимо иметь ра­циональную программу использования стандартов, вспомогательных материалов, их качественную и количественную статистику.

Стандартное вещество. Чистые вещества в стабиль­ной сухой порошкообразной форме, свободные от каких-либо на­полнителей или других фармацевтических материалов, являются основой, из которой готовятся все эталонные и контрольные смеси. Они должны находиться в стабильной форме соли, кислоты или основания, известной молекулярной формулы и веса. Образцы или метаболиты, полученные из различных источников, должны иметь 100%-ную чистоту.

Вещества, используемые как стандарты, должны быть проана­лизированы преимущественно масс-спектроскопией, газохромато- графически и (или) жидкостной хроматографией для того, чтобы определить примеси в них, перед тем как использовать их в лаборатории. В общем случае точную концентрацию вещества в растворе можно рассчитать, если известны его молекулярная фор­мула и величина навески. Внимание должно быть обращено на коррекцию молярной массы для кислых или основных солей, а также для гидратированной воды, когда готовятся эквивалентные (нормальные) концентрации свободных кислот и оснований. Реко­мендуется, чтобы стабильные чистые вещества хранились в сейфе, а нестойкие лекарства, идентифицированные по коду,— в холо­дильнике или в морозильной камере.

Эталонные растворы представляют собой растворы стандарт­ного вещества (лекарства) точной концентрации в дистиллирован­ной или деионизированной воде либо в органическом растворителе. Они применяются для аналитического контроля и (или) калибровки аналитических приборов. Эти растворы готовятся взвешиванием точного количества чистого вещества и растворением его в опре­деленном точном объеме органического растворителя (обычно эта­ноле или метаноле). Если вещество растворимо в виде соли, может быть использована вода. Эталонные растворы должны готовиться в .мерных склянках I класса точности, конечные растворы должны быть помечены, датированы, и должна быть указана фамилия приготовившего раствор. Очень важно, чтобы аналитические весы были точными и чувствительными и использовались в своих рабочих пределах.

Концентрация каждого эталонного раствора периодически дол­жна проверяться для определения его стабильности во время хранения. Хранение в холодильнике или в морозильной камере, в стеклянных виалах с плотно завинчивающимися тефлоновыми крышками обеспечивает устойчивость эталонов в течение дли­тельного времени. Обычно приготавливается два или три иден­тичных эталонных раствора для того, чтобы можно было их проверить относительно друг друга на стабильность и точность концентрации. Для "старых" стандартов всегда делаются парал­лельные испытания.

Из числа транквилизаторов бензодиазепины ос­таются непревзойденными по активности, спектру терапевтического действия и малой токсичности. Более того, с каждым годом перечень бензодиазепинов, обладающих физиологической активностью, не­прерывно расширяется как в ряду производных 1,4-бензодиазепина, так и за счет синтеза и внедрения в клиническую практику про­изводных 1,5- и 2,3-бензодиазепина. •

В эту группу входит около 100 наименований импортных и отечественных препаратов и более 2000 фармакологически актив­ных соединений данной структуры. Все более распространяющиеся факты злоупотребления соединениями данной группы послужили основанием для Комиссии ООН по наркотикам в 1984 г. отнести эту группу к соединениям, находящимся под международным конт­ролем. Общая формула и структура некоторых наиболее распро­страненных бензодиазепинов и продуктов их гидролиза приведены в табл. 18 и 19.