Наркотики

Газовый хроматограф Хром-5, колонка стеклянная, насадочная, силанизированная, длиной I метр, внутренний диаметр — 3 мм. Сорбент — 10%-ный, Карбовакс-1500 на инертоне AW-HMflS, фракция 0,16 — 0,20 мм. Газ-носитель — гелий, скорость — 75 мл/мин. Расход водорода — 30 мл/мин, расход воздуха — 400 мл/мин. Температура испарителя и детектора — 200°С. Тем­пературный режим колонки: анализ можно проводить как при программировании температуры от 130°С со скоростью 15° в минуту

Вещества данной группы в виде оснований являются летучими. Некоторые окисляются под действием кислорода воздуха. Поэтому для снижения неконтролируемых потерь на стадии выпаривания экстракта необходимо перевести анализируемое вещество в устойчивую солевую форму. Для этого используется 5%-ный раствор НС1 в метаноле, который добавляется к бензольному экстракту.

до 200°С и выдерживать конечную температуру до 12 минут общего времени анализа, так и в изотермическом режиме при 170°С для анализа эфедрона, эфедрина и норэфедрина и при 130°С для анализа метамфетамина и амфетамина. Объем вводимой пробы — 2 мкл.

Время удерживания анализируемых веществ и данные, харак­теризующие эффективность и селективность хроматографического разделения, представлены в табл. 37, 38.

Подготовка стеклянных насадочных колонок к анализу. Для удаления возможных загрязнений с внутренней поверхности колонок необходимо промыть их дистиллированной водой и органическими растворителями различной полярности в последовательности: этанол, хлороформ, ацетон, эфир (по 100 мл каждого на одну колонку). Колонки, которые ранее использовались в анализе биообразцов, перед промывкой заполнить хромовой смесью и выдержать 24 часа.

После промывки растворителями колонки промываются концен­трированной НС1 (100 мл) и дистиллированной водой до нейтраль­ной реакции среды, затем метанолом. Сушат в сушильном шкафу около 2 часов при температуре 250 — 300°С и теплыми продувают инертным газом. Заполняют 10%-ным раствором диметилдихлор- силана в безводном толуоле и оставляют заполненными на сутки. Далее сливают раствор и сушат при 150°С в течение часа. Несколько раз промывают метанолом и вновь сушат при 250° С один час.

Заполнение колонки насадкой. Концы колонки ос­тавляют незаполненными: на 2 мм конец, подсоединяемый к де­тектору; на 50 — 70 мм — конец, входящий в испаритель. Сорбент закрывают стекловатой слоем 2 — 3 мм.

Так как предполагается проводить анализ экстрактов из био­образцов, эндогенные вещества которых загрязняют испаритель и колонку, то следует использовать стеклянную вставку в колонку длиной 50 — 70 мм с воронкообразным расширением на одном конце для удобного ввода иглы микрошприца. По мере загрязнения вставка меняется на новую.

Стекловата и вставка должны обрабатываться диметилдихлор- силаном.

Кондиционирование насадки следует проводить без подсоедине­ния колонки к детектору с пропусканием газа-носителя со скоростью 20 — 30 мл в минуту. В течение первого часа колонка выдержи­вается при 100°С. Далее температура колонки изменяется со ско­ростью 3 — 5 об/мин до 290°С (колонка SE-30) и до 200°С (колонка Карбовакс-1500) и выдерживается в течение 8 — 12 часов.

 

В настоящее время компьютеризованный метод газовой хроматографии с масс-спектральным детектированием (ГХ/МС-метод) как высокоспецифичный, чувствительный и доста­точно быстрый получил широкое применение для целей клиниче­ской, судебной и токсикологической химии. Преимущество его использования для идентификации неизвестных ядов, наркотиче­ских и лекарственных веществ и их метаболитов признано повсе­местно. По сравнению с прочими методами надежность идентифи­кации существенно повышается из-за использования специфической характеристики вещества, каковой является масс-спектр, в допол­нение к параметрам удерживания, получаемым в хроматографи- ческом процессе.

Поскольку масс-спектр отражает структуру молекулы, то его детальное изучение, основанное на известных закономерностях образования ионов, позволяет сделать логический вывод о строении и формуле анализируемого соединения. Идентификация значитель­но облегчается использованием компьютерного поиска на основе библиотек программного обеспечения, являющихся непременной частью современных ГХ/МС/ЭВМ-систем.

В области фармацевтического, токсикологического и судебного анализа, в том числе для определения наркотических и сильно­действующих веществ, используются в основном два типа ГХ/МС/ЭВМ-систем, имеющих отличия в конструкции масс-спек­трометра и в программном обеспечении. Первый, фирмы "Хью- летт — Паккард", использует "масс-селективный детектор" (МСД), второй, фирмы "Финниган", оснащен "ионной ловушкой".

Данный материал относится к ГХ/МС/ЭВМ-системе "Хьюлетт — Паккард": газовый хроматограф НР-5890, серия II, МСД НР-5971А, станция контроля и обработки данных НР-59970С.

 

Многие лекарственные соединения, которые не относятся к нар­котическим и одурманивающим веществам, имеют индексы удер­живания, близкие к индексам удерживания анализируемых ве­ществ, и могут влиять на результаты идентификации при их одновременном присутствии в моче (сравните табл.36 и 34). В моче легко обнаруживаются кофеин и его метаболиты.

Следует отметить, что индексы удерживания анализируемых веществ имеют тенденцию к зависимости от концентрации анали­зируемого вещества в растворе. Четко выраженную зависимость от концентрации имеют индексы удерживания нитразепама, кофеина, морфина, эфедрина, эфедрона, фенобарбитала, теофиллина, стрих­нина, хинина.

В связи с концентрационной зависимостью индексов удержива­ния каждое соединение имеет определенный диапазон значений индекса удерживания — "окошко поиска". Для большинства веществ "окошко поиска" составляет ± 20 единиц индекса от среднего значения индексов удерживания, представленных в табл. 34, 36.

"Окошки поиска" некоторых веществ перекрываются. Поэтому на этапе предварительного обнаружения в таких случаях следует ориентироваться на несколько веществ с перекрывающимися "окош­ками поиска".

Необходимо учитывать, что экстракт III получают без предва­рительной экстракции при кислом значении рН среды. Поэтому при рН=8,5 — 9,0 наряду с веществами основного характера экс­трагируются вещества кислотного (барбитураты, теофиллин), ней­трального (мепробамат) и слабоосновного характера (кофеин, ан­типирин, амидопирин).

Предлагаемую методику общего газохроматографического скри­нинга наркотических и одурманивающих веществ следует приме­нять для отсева отрицательных проб и предварительного обнару­жения в положительных образцах веществ различных фармаколо­гических групп. Все пробы-, давшие положительный результат, подтверждаются в дальнейшем с учетом предварительной иденти­фикации любым другим надежным методом.   t

3. Газохроматографическое обнаружение фенилалкиламинов в моче

Предлагаемая методика газохроматографического анализа по­зволяет проводить обнаружение метамфетамина, амфетамина, эфед­рона, эфедрина и норэфедрина в моче без их предварительной дериватизации с использованием пламенно-ионизационного детек­тора. Газохроматографическое разделение анализируемых веществ можно проводить как при программировании температуры колонки, так и в изотермическом режиме. Время анализа не превышает 12 минут. Мешающего влияния фона эндогенных веществ мочи не установлено.

Область концентраций лекарственных и токсических соединений в организме (в частности, биожидкостях) изменяется в широких пределах. Диапазон 1,0 нг/мл — 10 мкг/мл в значительной степени отражает реальные величины, расширяясь вместе с тем до пико­граммов/мл в некоторых случаях анализа и до миллиграмма/мл при отравлении, например, сверхдозами наркотиков.

Калибровочные растворы готовят для диапазона концентраций в соответствии с задачами анализа. Как правило, диапазон охва­тывает два порядка, но в случае нелинейного калибровочного гра­фика может быть разделен на два более узких, в пределах которых линейность сохраняется.

В табл. 60 дается один из вариантов приготовления калибро­вочных растворов для диапазона 10 нг/мл— 10 мкг/мл.

Влияние матрицы на количественное определение извлекаемых соединений можно оценить, сравнивая параметры калибровочных графиков для растворов без матрицы (в подходящем растворителе, например в метаноле) и после извлечения из матрицы. Серия стандартных растворов в растворителе готовится в том же диапазоне концентраций, что и аналитическая проба. Изменение коэффици­ентов графика указывает на вклад влияния матрицы (при условии, что "реактивная ошибка" и прочие негативные последствия опера­ций пробоподготовки сведены к минимуму). Количественная оценка влияния матрицы может быть рассчитана как отношение концен­траций, определенных при анализе вещества в матрице и раство­рителе: [Сопр(матр.)/Сопр(станд.) ] х 100%.

Анализируемое соединение в неизвестной пробе подвергается в точности тем же операциям, что и при калибровке. Проба готовится в трех (или более) повторностях, начиная со стадии отбора аликвоты для гидролиза или изолирования.

Перед хроматографическим определением рекомендуется про­верить "остаточную память" колонки, вводя растворитель, исполь­зуемый для приготовления аналитической пробы. Затем проверка стабильности параметров хроматографической и детектирующей системы осуществляется при введении в 5 — 6 повторностях ре­конструирующего раствора, содержащего внутренний стандарт, и определении воспроизводимости измерения времени удерживания и площади пика внутреннего стандарта. Вслед за этим анализи­руется холостая проба с целью выявить наличие пиков эндогенных соединений, # также "реактивную ошибку" или другие негативные вклады операций пробоподготовки. При отсутствии холостой пробы из нативной биожидкости используют "стандартную" биожидкость, приготовленную растворением лиофилизованной мочи или плазмы или смешиванием равных объемов мочи от 15 — 30 здоровых до­бровольцев. При удовлетворительных результатах можно перехо­дить к анализу неизвестных проб.

Следует иметь в виду, что, прежде чем анализировать пробу в режиме селективного ионного мониторинга (SIM), необходимо убедиться в отсутствии неразрешенных пиков, особенно метаболи­тов, так как плохое разрешение веществ со сходными масс-спек­трами может привести к значительным ошибкам в количественном определении. Для этой цели пробу анализируют в режиме скани­рования, подбирая условия для хорошего разделения близких по структуре соединений.

Концентрация анализируемого вещества в пробе рассчитывается с помощью ЭВМ или по результатам интегрирования с применением метода наименьших квадратов. Если результат выходит за область линейности калибровочного графика, то пробу разводят в нужной пропорции и повторяют хроматографирование.

 

Все фенилалкиламины быстро всасываются в желудочно-кишечном тракте после орального введения, максималь­ная концентрация в крови достигается через 2 — 3 часа. За 24 часа выводится с мочой 70 — 90% вещества, полностью экскретируется за 2 — 3 дня.

Значение рН мочи значительно влияет на метаболизм и период полувыведения из плазмы крови:

—                при кислом значении максимален выход вещества в неизме­ненном виде с увеличением периода полу выведения;

—                при щелочном значении увеличивается процент метаболитов и снижается период полувыведения. В табл. 16 приведены основные фармакокинетические параметры фенилалкиламинов.

Амфетамин в неизмененном виде экскретируется с мочой лишь на 30%. В качестве его метаболитов определяются: 16 — 28% — гиппуровая кислота, 4%—бензоглюкуронид, 2 — 4%—4-гидро- ксиамфетамин, 2%—норэфедрин (схема 8).

Метамфетамин — в неизмененном виде с мочой выделяется около 45%. Основные метаболиты: 5% — амфетамин, 15%—4- гидроксиметиламфетамин (схема 9).

Эфедрин — в неизмененном виде выделяется 55 — 75%. Ос­новными метаболитами являются: 8 — 20%-—норэфедрин, 4 — 13%—безаминные метаболиты (бензойная и гиппуровая кислоты, фенилпропандиол). При щелочной моче выведение эфедрина сни­жается до 20 — 35%, соответственно увеличивается содержание норэфедрина (схема 10).

Норэфедрин — в неизмененном виде выделяется практически полностью — 90%. В качестве метаболитов обнаруживают малые количества амфетамина, эфедрина, диэтилпропиона.

 

Газовый хроматограф JIXM-80 с термоаэрозольным детектором (ТАД) или Perkin — Elmer F-22 с беспламенным азотно-фосфор- ным детектором (NPD). Колонка стеклянная, силанизированная, длиной 1 м, внутренний диаметр 2 — 3 мм. Сорбент — 3%-ный SE-30 на хромосорбе W (НР)-80 — 100 меш. Скорость газа-носи- теля —45 мл/мин азота для ТАД и 40 мл/мин гелия для NPD. Эффективность хроматографических колонок по додекану при 100°С для ТАД и NPD соответственно 1200 т.т и 1350 т.т. Селективность детектирования оптимизирована по кофеину и гексадекану. При этом установлены следующие расходы вспомогательных газов: для ТАД — 18 мл/мин водорода, 200 мл/мин воздуха, 135 мл/мин азота через генератор аэрозоля с хлоридом рубидия при температуре генератора 510°С; для NPD с шариком силиката рубидия — 1 мл/мин водорода и 60 мл/мин воздуха. Температура детектора 300°С. Температура испарителя 250°С. Температура термостата колонки изменяется по линейной программе от 130 до 290° С со скоростью 20°С в минуту. Выдерживание при конечной температуре занимает до 15 минут общего времени анализа. Объем вводимой пробы — 2,5 мкл.

Определение индексов удерживания. Для рас­чета индексов удерживания при работе с ТАД в качестве стандартов используются смеси н-алканов с числом атомов углерода от 10 до

32. Для регистрации углеводородов ТАД следует перевести в не­селективный режим (отключить нагрев генератора аэрозоля и по­дачу азота в генератор) пламенно-ионизационного детектора.

Расчет индексов удерживания при линейном программировании температуры колонки проводится с использованием абсолютного времени удерживания по формуле где RI(A) —индекс удерживания анализируемого вещества (А); tR(A) —время удерживания анализируемого вещества; tR(x) — время удерживания углеводорода с (х) числом атомов уг­лерода;

Метод не специфичен для отдельных барбитуратов, однако по­ложительная реакция имеет место, если одно из лекарств, указан­ных в табл. 26, присутствует. Сравнительное измерение возмож­ности использования различных методов для детекции барбитуратов (ТСХ, ГЖХ, ультрафиолетовая спектрофотометрия, РИА и ИФА) показало, что наименьший процент ложноположительных резуль­татов получен при использовании ИФА (около 2%
по сравнению с 3 и 4% для других методов). Кроссреактивность в ИФА барби­туратов значительно ниже, чем у амфетаминов.

Поскольку концентрация барбитуратов в моче и сыворотке колеблется в одном диапазоне концентраций (при содержании в моче от 1 до 5 мкг концентрация в сыворотке составляет 3 мкг), метод может быть использован для определения барбитуратов в моче и сыворотке. Таким образом, если образец мочи детекти­руется на содержание барбитуратов как отрицательный, прове­дение аналогичного анализа в сыворотке должно показать отри­цательный результат; несоответствие может наблюдаться только при короткодействующих барбитуратах. Чувствительность ИФА барбитуратов коррелирует с чувствительностью РИА для одних и тех же категорий барбитуратов, абсолютная специфичность обоих методов одинакова.

Производные 1,4-6 ензодиазепина. ИФА 1,4-бен- зодиазепинов использует конъюгаты фермента с оксазепамом. Ок- сазепам, общий метаболит для всех бензодиазепинов, обнаружи­вается в моче пациентов, проходящих курс терапии бензодизепи- нами. Кроссреактивности с другими лекарственными препаратами в литературе не отмечено, анализ высокоспецифичен, чувствитель­ность метода — 0,5 мкг/мл. Достаточно высокое время полувыве­дения этого метаболита и высокая чувствительность позволяют детектировать введение в организм около 10 мг диазепама спустя 48 часов.

Метаболиты кокаина.
Основными метаболитами ко­каина, определяемыми в моче, являются бензоилэкгонин и экгонин. Ввиду плохой растворимости их в органических растворителях при использовании для детекции хроматографических методов (ТСХ, ГЖХ) в ряде образцов не удается определить присутствие мета­болитов кокаина, несмотря на введение в организм достаточно высоких концентраций этого соединения. Постановка ИФА исклю­чительно проста, чувствительность — около 1 мкг/мл, анализ вы­сокоспецифичен. Чувствительность РИА выше — около 0,1 мкг/мл, однако простота и доступность ИФА делают его незаменимым при определении этого класса соединений.

М е т а д о н. Метод обнаружения метадона основан на опреде­лении свободного метадона и не является специфичным по отно­шению к метаболитам этого соединения. ИФА позволяет детекти­ровать 0,5 мкг/мл свободного метадона в моче, чувствительность РИА приблизительно в 5 раз выше, а тонкослойной хроматогра­фии — в 4 раза ниже, чем ИФА. Преимущество использования ИФА состоит в быстроте и сравнительной простоте постановки эксперимента.

Опиаты. Применение ИФА для определения опиатов не тре­бует предварительного гидролиза, как при использовании тонко­слойной или газожидкостной хроматографии. Метод разработан для детектирования свободного морфина и конъюгатов морфина с глю- куроновой кислотой, обладающих перекрестными реакциями с ко­деином. Чувствительность метода по отношению к кодеину выше, чем к морфину. Можно отметить, что использование любого им- мунохимического метода не позволяет различать опиаты индиви­дуально; для их идентификации обычно используют методы газовой и тонкослойной хроматографии, флюорометрию.

Чувствительность определения и относительная реактивность опиатов представлены в табл. 27.

 

Ногти содержат 10,1 — 13,7% воды и 0,15 — 0,76% жиро- подобных веществ (холестерин и его эфиры). Из органических веществ основным является белок кератин, устойчивый к воздей­ствию различных химических веществ, а из минеральных веществ — кальций, фосфор, цинк, мышьяк и др. В нашей стране факт накопления в ногтях наркотических соединений, и прежде всего опиатов, установлен недавно Е.А. Симоновым. Однако данных по определению наркотиков в ногтях еще недостаточно.

Желчь является продуктом секреторной деятельности печени, желчного пузыря и двенадцатиперстной кишки. Эта жидкость со­держит большое количество воды, эндогенных веществ, подобных тем, которые находятся в крови, плазме и сыворотке, а также желчные кислоты и пигменты. Желчь различается по величине рН (в пределах 6,7 — 8,3), что заставляет контролировать рН в ходе подготовки к экстракции, а при необходимости использовать подходящий буфер. Рекомендуется также пробу центрифугировать при низких скоростях (для удаления холестерина) и осадить белки добавлением смеси хлороформ — метанол (2:1) или хлороформ — изопропанол (9:2).

При экстракции из желчи желчные кислоты образуют стойкую эмульсию, поэтому для разделения фаз необходим длительный период центрифугирования; так как большинство токсических ве­ществ выделяется из желчи в виде конъюгата с глюкуроновой кислотой, желчь перед экстракцией подвергают гидролизу или обработке р -глюкуронидазой, а затем уже проводят экстракцию.

Экстракты из желчи часто окрашены, что затрудняет их спек- трофотометрирование. Предварительное осаждение белков несколь­ко осветляет пробы.

Вследствие липофильного характера большинства эндогенных веществ желчи экстракты обладают значительным фоном, особенно при использовании неполярных растворителей. Желчь экстрагиру­ется по схеме 18.

Фекалии. Этот биообъект анализируется на содержание ток­сического вещества, которое экскретируется вместе с желчью, а также если известно, что оно не полностью абсорбировалось в желудочно-кишечном тракте после орального введения.

Для длительного хранения пробы замораживают или лиофили- зируют, чтобы замедлить действие бактериальной флоры и умень­шить неприятный запах. Основная преда налитическая обработка состоит в гомогенизации пробы. Высушенные образцы, как правило, дают более воспроизводимые результаты. Экстракция проводится по схеме 18 или 20 при соответствующих значениях рН.

Основные эндогенные соединения — желчные кислоты, стерои­ды, сахара и порфирины. Вследствие присутствия в биообъекте большого количества экзогенных веществ, поступивших с пищей, результаты анализа отличаются большой вариабельностью.

Пробу мочи после кислотного гидролиза цен- трифугируют при рН=9,0 — 9,3, и декантированную надосадочную жидкость экстрагируют 20 мл смеси изобутанол — метиленхлорид (1:9). Органический слой промывают 10 мл буферного раствора рН=9,0 (0,05 М калийфосфатный буфер) и подвергают реэкстракции 6 мл, 0,2 н раствора ацетата натрия с рН=1,0 (1 — 2 капли ледяной уксусной кислоты). Водную фазу доводят до рН=9,0 с помощью 3,5 мл 0,75 М раствора карбоната натрия и экстрагируют 10 мл смеси изобутанол — метиленхлорид (1:9). Органический слой упа­ривают досуха в токе азота при 50°С, растворяют в 100 мкл по­движной фазы и анализируют.

Тестовая смесь "А" — метанольный раствор каждого из следу­ющих веществ в концентрации 100мг/л (в скобках указана вели­чина индекса удерживания): барбитал (1497), этаминал натрия (1740), дифенгидрамин (1873), фенобарбитал (1957), метаквалон (2125), кодеин (2376), морфин (2455), налорфин (2577), хинин (2803), галоперидол (2942), стрихнин (3119).

Эта тестовая смесь охватывает широкую область значений R1 наркотиков. После инжектирования 1 мкл всех соединений (150 нг каждого) должно наблюдаться детектирование соединений тестовой смеси (детектор ПИД) и хорошее разделение соединений с доста­точно четкими пиками. Тестовая смесь стабильна в течение 2 ме­сяцев при хранении в холодильнике (4°С). Раствор этих же сое­динений с концентрацией 1 г/л в метаноле стабилен в течение 2 лет (в холодильнике).