Наркотики

Выбор того или иного варианта дериватизации определяется задачей ГХ/МС-анализа. Так, при групповом анализе фенолалкила­минов предпочтительным оказывается третий вариант дериватиза­ции, поскольку он ведет к появлению общего, группового иона m/z:179 или 267 (табл.57).

Одна и та же функциональная полярная группа реагирует в различной степени в зависимости от ее положения в молекуле: гидроксил фенольный, алкильный и аллильный проявляют разную активность по отношению к некоторым агентам дериватизации (МБТФА). Стерические затруднения могут приводить к полной остановке дериватизации, например, в N-этил- или N-бутилзаме- щенных вторичных аминах.

Перед ГХ/МС-анализом необходимо удалить избыток фторсо- держащих ангидридов (ТФАА и др.), которые негативно влияют на хроматографическую систему. Силилирующие агенты обычно вводят в колонку в составе дериватизованной смеси, однако их избыток ухудшает рабочие характеристики МСД, загрязняя метал­лические поверхности.

От качества проведения всех операций пробоподготовки в зна­чительной мере зависят результаты ГХ/МС-анализа.

Для контроля этой стадии в состав серии анализируемых проб обязательно включают холостые образцы биожидкости, не содер­жащие лекарственного вещества, которые подвергаются всем опе­рациям аналогично исследуемой пробе. Холостая проба показывает собственный фон биожидкости и контролирует степень очистки от эндогенных компонентов, а также возможные загрязнения из рас­творителя и прочих реактивов ("реактивная ошибка"), материала пробок, прокладок, посуды и т.п. Эти эндогенные и экзогенные соединения образуют фон и в некоторых случаях дают на хрома- тограмме интенсивные пики, сравнимые с анализируемыми.

 

 Некоторые нежелательные процессы хроматографическо­го и масс-спектрального определения

В целях использования всех возможностей хромато-масс-спек- трального метода для получения стабильных и достоверных ре­зультатов высокой точности необходимо избежать нежелательных побочных процессов, которые могут идти при хроматографировании или в масс-спектрометре. Эти процессы приводят к потере вещества или его трансформации, что затрудняет или искажает как иден­тификацию, так и количественное измерение.

Для лекарственных и токсических веществ наиболее часто встре­чаются следующие:

—                 термическое разложение в инжекторе или в колонке: декар- боксилирование кислот; деацетилирование диацетилморфина (герои­на), в процессе которого катализатором являются металлы (никель); разложение 3-гидроксибензодиазепинового кольца (оксазепам, лора- зепам, темазепам); разложение хлордиазепоксида и его метаболита, причем в двух последних примерах регистрация масс-спектра ведется для воспроизводимо образующихся стабильных продуктов реакции;

—                 адсорбция полярных соединений в инжекторе и в колонке (морфина, барбитуратов и многих других);

—                 потери веществ из-за недостаточной летучести или непра­вильно подобранных условий хроматографического анализа.

Гомогенный ИФА более экспрессный, время проведения анализа занимает от 1 до 30 минут, включая обработку результатов. Предел обнаружения составляет от 10" до 10" г/мл. Гомогенный ИФА используется при скрининге большого количества образцов для предварительного установления факта употребления одурманива­ющих средств. Недостатком гомогенного анализа является доста­точно высокий фон.

Гетерогенные методы характеризуются высокой чувствительно­стью С10" — 10" г/мл), но более длительным временем проведения анализа (от 2 до 4 часов).

Наиболее чувствительным и удобным среди иммунологических методов количественного определения наркотических и других одур­манивающих средств в биожидкостях является поляризационный иммунофлюоресцентный анализ (ПФИА) (см. раздел 8.2). ПФИА— гомогенный конкурентный метод иммуноанализа. Поляризацию флюоресценции комплекса "антитело — антиген", меченного трас- сером-флюоресцеином, замеряют прямо в растворе, используя осо­бые свойства метки. Изменение степени поляризации испускаемого флюоресцентного света зависит от степени связывания трассера с антителом. Поляризацию флюоресценции измеряют с помощью специальной оптической системы детекции. ПФИА имеет ряд пре­имуществ перед ИФА: большую точность (до 200нг/мл), стабиль­ность метки, меньшую подверженность влиянию температуры и рН среды, характерному для фермент-субстратных отношений, а также быстроту и простоту проведения анализа. Фирмой "Эбботт" (США) создана автоматизированная система TDX для мониторинга и анализа лекарственных и наркотических средств.

В нашей стране ВНИИ биологического приборостроения выпу­скаются поляризационные флюоресцентные анализаторы АФП-2, позволяющие использовать данный метод для анализа средств, вызывающих одурманивание.

Совмещение высокой специфичности, точности анализа с экс- прессностью и простотой выполнения позволяет использовать метод иммуноанализа с помощью индикаторных полосок, дающий воз­можность осуществлять экспресс-диагностику не в лабораторных ("полевых") условиях. В основе метода лежит система детектиро­вания по принципу "ферментных каналов". Суть ее заключается в том, что ферменты, катализирующие последующие реакции пре­вращения хромогенного субстрата в окрашенное соединение, по­мещают в особое микроокружение с ограниченной диффузией. Например, если иммобилизовать их на твердом носителе, то ско­рость катализа сопряженных реакций будет выше при нахождении ферментов на поверхности твердой частицы, чем в случае раздель­ного действия ферментов.

Метод использует два фермента — глюкозооксидазу и перокси- дазу. Антитела и глюкозооксидазу ковалентно связывают с поверх­ностью индикаторной полоски — целлюлозой хроматографической бумаги. Второй фермент — пероксидазу — используют для получе­ния конъюгата с определяемым веществом.

Контрольная модельная смесь барбитала, фе­нобарбитала, циклобарбитала, барбамила и этаминала натрия го­товится в растворе подвижной фазы. Для этого:

а)  берутся навески барбитала (10 ± 0,5 мг), фенобарбитала (12 ± 0,5 мг), циклобарбитала (22 ± 0,5 мг), барбамила (21 ± 0,5 мг), этаминала натрия (35 ± 0,5 мг);

б)  навески переносятся в колбу 50 см , объем доводится до метки, смесь встряхивается до полного растворения и фильтруется. Смесь должна сохраняться при + 4°С в темноте.

Хроматографирование модельной смеси проводится при следу­ющих условиях: расход элюента—100мкл/мин; объем вводимой дозы — 4 мкл; масштаб регистрации — 0,4 е.о.п.; время измере­ния — 0,4 с; длина волны — 240 нм. Хроматограмма анализа мо­дельной смеси приведена на рис. 36, а основные хроматографические параметры — в табл. 45.

В соответствии с методикой изолирования эфед­рина и эфедрона из образца мочи [5] к 10 мл мочи добавляется 5% раствора гидроксида натрия до рН=11, 10 мл бензола и 5 мкл раствора амфетамина (используемого в качестве внутреннего стан­дарта) с концентрацией 10 мг/мл. После встряхивания в течение 3 минут и центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут бензольный слой упаривается досуха в токе холодного воздуха. Сухой остаток растворяется в 0,5 мл подвижной фазы, и 2 — 10 мкл вводится в хроматографическую колонку. На рис. 44 и 45 приведены хроматограммы экстрактов из пробы холостой мочи, не содержащей анализируемых веществ, и из мочи, содержащей эфедрин, эфедрон и амфетамин (внутренний стандарт) с концентрациями соответст­венно 50, 50 и 4 мкг/мл.

 

Легкоинтерпретируемые ИК-спектры получаются при работе с растворами в четыреххлористом углероде. Однако низкая раство­римость в нем многих бензодиазепинов не всегда позволяет получать такие спектры. Спектры кристаллических образцов 1,4-бензодиа- зепинов, как правило, сложнее вследствие межмолекулярных вза­имодействий. В них достоверное отнесение можно сделать только для некоторых характеристических полос (табл. 21).

Растворы 1,4-бензодиазепинов более стабильны в спирте, чем в воде. В кислых водных растворах, особенно при нагревании, 1,4-бензодиазепины гидролизуются с образованием производных аминобензофенона, имеющих желтую окраску. Особенно быстро

гидролизуются оксазепам и диазепам; напротив, феназепам и ме- дазепам с трудом поддаются гидролизу. В присутствии очень малого количества воды (1%) в качестве продукта разложения может также получаться хинолон.

 Внести в лунки Ai и Bi по 0,05 мл раствора 5. В лунке Ai — позитивный контроль. В лунки с Bi по Hi внести по 0,05 мл раствора 4. Для построения градуировочного графика при­готовить CP №2 — 8 с концентрацией определяемого вещества 250, 127, 62, 31, 15, 5 и 7 мг/мл соответственно путем последовательного разведения в 2 раза раствором 4. Начиная с лунки Bi из объема 0,1 мл переносить последовательно по 0,05 мл в последующие лунки до Hi. Из лунки Hi 0,05 мл следует удалить. После окончания этой процедуры в каждой лунке с Ai по Hi должно быть по 0,05 СР.

Возможно также приготовить на планшете второй ряд СР.

Внесение анализируемых образцов мочи. Все пробы мочи раз­водят в 10 раз. Внести каждый разведенный в 10 раз образец мочи в две лунки по 0,05 мл в каждую.

Внесение отрицательного контроля.
Отрицательный контроль (Рю), предварительно разведенный в 10 раз аналогично операции 2.2.2, вносят в лунки Ап и А12 по 0,05 мл.

Связывание антигена с антителами, меченными пероксидазой хрена (инкубация). Раствор 6 вносят по 0,05 мл во все лунки, инкубирование проводят в течение 5 минут на встряхивателе (шей- кере) и в течение 60 минут в биологическом термостате при температуре 37 ± 2°С.

Отмывку планшета проводят аналогично промывке.

Внесение хромогенного субстрата. Раствор субстрата готовят непосредственно перед внесением и сразу же вносят по 0,2 мл во все лунки планшета, выдерживают 20 — 15 минут (в зависимости от качества воды и других неучитываемых факторов) при комнатной температуре и останавливают реакцию, добавляя во все лунки планшета по 0,025 мл раствора соляной или серной кислоты с концентрацией 2 моль/л. Добавление кислоты для остановки ре­акции необходимо производить максимально быстро, чтобы интер­вал времени между добавлением кислоты в первую и последнюю лунки был минимальным.

1.3.                        Интерпретация результатовРезультаты анализа оценивают визуально, сравнивая окраску лунок стандарта с окраской лунок в исследуемых пробах (качест­венный анализ или спектрофотометрическии при длине волны 492 нм (количественный анализ). Концентрацию морфина в исследу­емых пробах определяют по градуировочной зависимости концен­трации стандарта морфина от соответствующей средней оптической для параллельных определений в полулогарифмических координа­тах.

Реконструирование проводится непосредственно перед вводом аналитической пробы в инжектор хромато-масс-спектрометра.

Получение смешанных производных для веществ с различ­ными функциональными группами: например, в молекуле 11-нор- 9-карбокси-тетрагидроканнабинола метилируют СООН-группу и си- лилируют ОН-группу; в молекуле фенолалкиламинов силилируют фенольный гидроксил и ацилируют аминогруппу.

Наиболее употребляемые агенты силилирования: N,0-6hc (триметилсилил)-ацетамид (БСА), N,0-6hc (триметилсилил)-трифторацетамид (БСТФА), N-метил (К-триметилсилил)-трифторацетамид (МСТФА) и ацилирования:

N-метил-бис (трифторацетамид) (МБТФА), трифторуксусный ангидрид (ТФАА), гептафтормасляный ангидрид (ГФМА), пентафторпропионовый ангидрид (ПФПА). Одна и та же полярная группа может быть преобразована с помощью различных агентов дериватизации. Так, гидроксил опи­атов, экстрагированных из мочи,— морфина, кодеина и налорфина (внутренний стандарт)— может быть переведен в неполярную груп­пу по реакциям перфторэтерификации (с ПФПА или ГФМА), трифторацетилирования (с МБТФА), силилирования (с БСТФА/1 % триметилхлорсилана) или ацетилирования (с уксусным ангидридом в безводном пиридине). Выбор реакции дериватизации имеет важное значение для количественного определения (SIM) и основан на следующих основных критериях:

—                 хорошее разделение дериватов на хроматограмме;

—                 наличие интенсивных пиков в масс-спектре, обеспечивающих хорошую чувствительность;

—                 стабильность деривата во времени;

—                 отсутствие расщепления пиков дериватов на хроматограмме.

Руководствуясь этими критериями, рекомендуется применять для смеси опиатов два реагента: БСТФА с 1 % триметилхлорсилана или уксусный ангидрид в пиридине. ПФПА и ГФМА образуют дериваты, обладающие "плохим" масс-спектром: вторичные и тре­тичные ионы имеют низкую интенсивность. Трифторацетилирова- ние приводит к расщеплению пика налорфина (моно- и ди-ТФА- налорфин) с изменяющимся во времени количественным соотно­шением и, кроме того, образует нестабильный дериват морфина: 3,6-ди-ТФ А-морфин.

Аминазин, дипразин, левомепромазин, тиори- дазин являются наиболее часто встречающимися препаратами, на которые анализируются биологические объекты.

Данные соединения в виде оснований плохо растворяются в воде, хорошо — в этаноле, хлороформе, эфире. Высокая липофиль- ность фенотиазинов обусловливает их депонирование в жировых тканях, вследствие чего они обладают большим периодом пол у вы­ведения, т.е. медленно выводятся из организма. Все фенотиазины относятся к веществам основного характера. Так, величина рКа для аминазина — 9,3, дипразина — 9,1, тиоридазина — 9,5, лево- мепромазина — 9,3.

Растворы производных фенотиазина интенсивно поглощают к ультрафиолетовой области спектра. В их спектре отмечаются два максимума — 250 — 255 и 320 нм. Положение максимума опреде­ляется видом и положением заместителей в молекуле фенотиазина.

Метаболиты^ особенно сульфоксиды, имеют более сложный спектр, например, в разбавленной кислоте спектр хлорпромазин- сульфоксида характеризуется четырьмя максимумами — при 239, 274, 300 и 341 нм.

Основные характеристические частоты ИК-спектров, отражаю­щие типы связей и функциональных групп фенотиазинов, сведены в табл. 23.

Производные фенотиазина являются химически очень лабиль­ными соединениями, особенно легко окисляется атом серы, давая различные продукты сульфоокисления. Радикальные реакции окис­ления одинаково легко осуществляются как в растворах этих ве­ществ в условиях окружающей среды, так и в живом организме.

Основные метаболитические реакции — это сульфоокисление’, N-деметилирование, гидроксилирование, окисление, конъюгация с глюкуроновой кислотой.

Главным путем выведения фенотиазинов является моча. Мето­дики определения производных фенотиазина в биологических жид­костях описаны в методических указаниях "Химико-токсикологи­ческий анализ веществ, вызывающих одурманивание" (М.: МЗ СССР. 1989); более подробные сведения об анализе фенотиазинов можно найти в работах Е.М. Соломатина.ГЛАВА 4

На стадии пробоподготовки образец очищается от загрязнений, которые не следует отбрасывать, так как они могут быть источником дополнительной информации. Пробоподготовка — это стадия риска потерять анализируемое вещество и объект. По­этому нелишне помнить о необходимости строгих и логически оправданных действий, направленных на сохранение образцов, ото­бранных для анализа, для дальнейшего исследования.

На стадии пробоотбора в анализе наркотических средств следует учитывать возможность уничтожения или фальсификации объекта; анализируемая проба может быть мала по массе, загрязнена и иметь химический состав, отличный от первоначального из-за воз­действия окружающей среды при неправильном хранении.

При пробах небиологического происхождения (растительное сырье, порошки, таблетки, экстракты и проч.) навеска для анализа отбирается произвольно, если только она не оговорена методикой и не ограничена малым объемом образца. Самая маленькая проба должна, быть проанализирована самыми чувствительными методами. Критерием выбора метода в этом случае является предел обнару­жения вещества. Образцы небиологического происхождения, как правило, изымаются в процессе оперативно-следственных меро­приятий и являются вещественными доказательствами.

Вид, количество биообразца, исследуемая аликвота в случае судебно-химического анализа, устанавливающего причины смерти, регламентируются соответствующими методическими письмами и рекомендациями.

Наиболее распространенным биологическим объектом для обна­ружения в нем наркотических средств является моча. Выбор этого биообъекта для анализа обусловлен несколькими причинами. Во- первых, моча представляет собой один из самых информативных объектов, так как большинство наркотических веществ и их ме­таболиты выводятся из организма с мочой. Во-вторых, по сущест­вующим юридическим нормам процесс отбора биопробы не должен причинять обследуемому физического неудобства. Среди других биообъектов при анализе наркотических средств могут быть взяты на анализ кровь, слюна, волосы и др.

Процедура отбора пробы мочи должна обязательно проводиться под наблюдением
персонала для предупреждения замены или порчи пробы. Необходимо учитывать, что проба может быть заменена образцом в заранее принесенном контейнере (грелка, склянка и т.д.), проба может быть испорчена добавлением воды, принесенного с собой уксуса, отбеливателей и других химических реагентов.Объем отбираемой мочи должен быть не менее 250 мл. В случае меньшего количества биообразца в итоговом протоколе этот факт должен быть обязательно отмечен.

При погружении индикаторной полоски в исследуемый образец (моча, слюна и др.) происходит образование иммунных комплексов между антителом, иммобилизованным на хроматографической бу­маге, и присутствующим в анализируемом образце свободным нар­котиком пропорционально его концентрации. Затем полоску поме­щают в раствор, содержащий: а) конъюгат (определяемый нарко­тик — пероксидаза), б) глюкозу и в) хромогенный субстрат (на­пример, хлорнафтол).

При инкубации конъюгат связывается с вакантными активными центрами антител, при этом при взаимодействии глюкозы, с им­мобилизованной глюкозооксидазой происходит последовательная ге­нерация перекиси водорода, которая затем окисляет хромогенный субстрат с образованием нерастворимого окрашенного продукта. Концентрация антигена (определяемого вещества) в исследуемом образце обратно пропорциональна интенсивности развиваемой на полоске окраски. Описанный иммунохроматографический метод является пр инципиально новым и отличается тем, что концен­трация вещества определяется не по ферментативной активности конъюгата, а по его хроматографической подвижности.

Благодаря простоте выполнения и возможности стандартизации иммунохроматографический метод имеет большую перспективу. Он может использоваться в отделениях милиции, спецприемниках, патрульных автомобилях и т.д.

Производные 1,4-6 ензодиазепина. Аликвоты 1а и 2а (см. схемы 25 и 26) в мерной пробирке на 10— 15 мл или колбе упаривают досуха на кипящей водяной бане. К остатку добавляют 5 мл 6 н НС1 и содержимое нагревают в колбе с обратным холодиль­ником на кипящей водяной бане 60 минут. Гидролизат охлаждают, нейтрализуют насыщенным раствором NaOH до рН=7— 9. Получен­ный раствор переносят в делительную воронку и продукты гидролиза производных 1,4-бензодиазепина — соответствующие аминобензофе- ноны экстрагируют равным объемом хлороформа. Нижнюю органи­ческую фазу отделяют, фильтруя через безводный сульфат натрия; хлороформ упаривают в токе теплого воздуха приблизительно до объема 0,2 мл, который количественно переносят на стартовую линию пластинок "Силуфол". Хроматографирование проводят в системе бен­зол. Обнаружение — по собственной окраске, свечению в УФ-области и реакции Браттона — Маршалла.

Производные барбитуровой кислоты. Аликвоты 16 и 1в упаривают раздельно досуха. Остатки растворяют приблизи­тельно в 0,2 мл хлоро4юрма и наносят каждый раствор на отдельную пластинку "Силуфол". В качестве метчиков используют спиртовые растворы барбитала, барбамила и ноксирона (наносятся раздельно). Пластинку с аликвотой 16 хроматографируют в системе 1-.хлоро­форм — ацетон (9:1), с аликвотой 1в — в системе 5:толуол — аце­тон — этанол — 25%-ный аммиак (45:45:7,5:2,5). Длина пробега — 10 см. Обнаружение — обе пластинки опрыскивают сначала раствором сульфата ртути, затем раствором дифенилкарбазона в хлороформе (избегая его избытка).

Барбитураты и ноксирон обнаруживают в виде сине-фиолетовых или красных пятен на исчезающем сиреневом фоне. Значение величин Rf метчиков охватывает весь интервал значений Rf производных барбитуровой кислоты и ноксирона.