ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)
В иммуноферментных методах для детектирования реакции "антиген — антитело" в качестве метки (маркера) используются ферменты. Как правило, они представляют собой различные оксидазы, способные окислять (специальное химическое вещество — хромогенный субстрат) с образованием окрашенных продуктов. По интенсивности окраски и судят о присутствии или отсутствии наркотического средства в анализируемой пробе.
По технике выполнения различают два типа иммуноферментного анализа (ИФА): гомогенный ("Сива", ЭМИТ) и гетерогенный (ИФАВ РАН, "Хоффман-ла Рош").
В гомогенном ИФА все компоненты реакции — антитела (антисыворотки), определяемое вещество, меченое определяемое вещество (конъюгат), хромогенный субстрат — находятся в одном агрегатном состоянии — растворе. На первой стадии анализа в реакционной среде присутствуют одновременно три компонента: аликвота анализируемой биопробы, конъюгат (определяемое вещество с ферментной меткой) и антитело (антисыворотка). Вследствие обратимости реакции связывания "антитело — антиген" определяемое вещество биопробы (гаптен) и конъюгат (меченый гаптен) конкурируют между собой за ограниченное число мест связывания антитела.
Меченый антиген, связанный с антителом, не дает окраски вследствие потери активности фермента за счет пространственных затруднений. Меченый антиген получают с помощью специфических химических приемов, в результате чего определяемое вещество ковалентно связывается с ферментом.
На второй стадии анализа к реакционной смеси добавляется хромогенный субстрат, который под Действием фермента-метки претерпевает химическое изменение, превращаясь в окрашенное соединение. Полученная окраска регистрируется визуально или с помощью спектральных методов.
В гомогенном ИФА в качестве метки используются следующие ферменты: лизоцим, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа. При связывании меченого гаптена с антителом активность фермента-метки в реакции с хромогенным субстратом снижается за счет пространственных изменений белка фермента (блокируется доступ субстрата к ферментативным центрам). Это явление называется торможением. В этом случае окраска анализируемого раствора после добавления субстрата будет прямо пропорциональна концентрации не вступившего в связь с антителом меченого гаптена, т.е. прямо пропорциональна концентрации конкурента — наркотика, находящегося в биопробе.
В наиболее распространенных случаях гетерогенного ИФЛ антитело иммобилизуется на каком-либо твердом носителе, например полистирольных планшетах, пробирках, бусах.
